导语 从连接子角度盘点HER2靶向ADC的性质特点 整体而言，连接子分为可裂解和不可裂解两类，不同ADC采用的连接子技术不同，相应的偶联方式和DAR也有区隔，并且旁观者效应仅发生在采用可裂解连接子的ADC药物中。本文从连接子角度着手分析，目前市面上已经获批或者在研的几款代表性HER2靶向ADC药物：T-DXd)/ target=_blank class=infotextkey>DS-8201、SYD985、RC48、T-DM1、ARX788在这方面的差异。 表1. 不同HER2靶向ADC的属性 常见ADC药物的连接子 连接子将抗体和有效载荷连接起来，是ADC研发成功的关键。连接子在血浆中需能稳定存在，以避免载荷提前释放损伤正常组织或细胞。当 ADC 药物被内吞进入靶细胞后，连接子能有效裂解快速释放载药。另外，还应该考虑到连接子的分子量和极性对ADC药物整体性质的影响[1]。基于载药的释放机制，连接子可分为可裂解和不可裂解两大类，其中可裂解连接子又可以分为蛋白酶敏感性、PH敏感性、谷胱甘肽敏感性三种[2]。 图1. ADC的结构特点，连接子分为可裂解型和不可裂解型 目前市面上已经获批或者在研的几款HER2靶向ADC药物中，T-DXd)/ target=_blank class=infotextkey>DS-8201、SYD985、RC48都属于酶切可裂解连接子，而T-DM1和ARX788属于不可裂解连接子。其中DS-8201采用基于GGFG四肽，并且结构中引入?氨基亚甲基（AM）作为间隔单元的连接子，通过马来酰亚胺己酰基团（mc）与曲妥珠单抗的半胱氨酸残基偶联，其连接子可以表示为mc-GGFG-AM，与传统采用对氨基苄基(PAB)作为间隔单元的ADC（如SYD985和RC48）相比，其降低了疏水性，并在体循环中保证稳定性[3]。在人、猴、大鼠、小鼠血浆中，该连接子高度稳定，载药在21天的释放率不到4%，人血浆中释放率仅约2%[4]。DS-8201经HER2受体介导内吞后，连接子的四肽结构能被?肿瘤细胞内高表达的溶酶体蛋白酶特异性识别和切割，AM也会迅速水解为氨和甲醛，从而高效释放载药[3,5]。? 图2.DS-8201的结构图 SYD985[6]和RC48[7]均采用缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit，VC)二肽连接子，可被肿瘤细胞中的组织蛋白酶B识别和裂解。为了更好地发挥组织蛋白酶B的降解活性，通常会在VC二肽连接子中引入对氨基苄氧羰基(PABC)，PABC基团作为间隔单元，能提供足够的空间使得VC二肽基团被组织蛋白酶B识别，在二肽结构被裂解后， PABC很快会发生自身降解，释放载药分子。并且连接子通过mc与抗体偶联，即SYD985和RC48的连接子实际上也可以描述为mc-Val-Cit-PABC/ Val-Cit-PABC。此外，研究表明，Val-Cit-PABC在血浆中的半衰期为80h[2,8]。 图3. SYD985的结构图 图4. RC48的结构图 T-DM1采用的是不可裂解的硫醚连接子（SMCC），T-DM1被内吞进入肿瘤细胞后，经溶酶体对抗体部分的快速降解，形成抗体赖氨酸残基-连接子-载荷复合物（lysine-Nε-MCC-DM1）作为杀灭肿瘤细胞的效应分子[9]。尽管理论上，不可裂解连接子相比可裂解连接子在循环血液中的稳定性更高，可减少脱靶效应[10]，但研究表明T-DM1?在人、猴、大鼠、小鼠血浆中，?4天时载药释放率已达18.4%，远高于DS-8201[5]。 图5. T-DM1的结构图 ARX788采用的是不可裂解的非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸(pAF) -羟胺-PEG4连接子[11]，ARX788进入肿瘤细胞后，在溶酶体中被水解，释放出pAF-AS269发挥抗肿瘤杀伤作用。该连接子偶联到单甲基auristatin F(MMAF)的N末端，不影响载荷的活性[12,13]。 图6. ARX788的结构图 连接子对偶联策略及DAR的影响 连接子决定了ADC采取的偶联策略，偶联位点与ADC药物的均一性相关，也是药物抗体比（DAR）分子设计的重要考量因素之一[14]。ADC的偶联策略主要包括非定点偶联和定点偶联。非定点偶联是在不对抗体进行改造或修饰的情况下，利用化学方法直接将药物与抗体上氨基酸残基进行偶联，包括赖氨酸偶联和半胱氨酸偶联。 典型IgG1抗体大约有85个赖氨酸残基，其中抗体表面可偶联的赖氨酸残基位点超过40个，?偶联的载药个数和偶联位置都具有随机性，得到的ADC为异质性混合物[6]。T-DM1则是典型的采用赖氨酸偶联的ADC，其DAR分布于0-7，为平均DAR为3.5的混合物[15]。 图7. 赖氨酸酰胺偶联技术 （活化的羧酸基团与赖氨酸残基反应，导致抗体和有效载荷之间的酰胺键连接，优化偶联条件可得到的平均DAR一般为3.5-4的混合物。） IgG1抗体的重链和轻链中含有通过半胱氨酸残基形成的12个链内二硫键和4个链间二硫键。在受控的还原条件下，IgG1抗体中的4个链间二硫键可被全部还原成含有游离巯基(Cys-SH)的8个半胱氨酸残基，而链内二硫键则保持完整，因此得到最多8个可偶联半胱氨酸残基位点，相比赖氨酸偶联的复杂程度有所降低，因而采用半胱氨酸偶联产生的ADC异质性也更低[2,6]。 并且理论上，采用半胱氨酸偶联的ADC，其偶联的载药数量可能为2、4、6、8，?偶联条件如投料比、温度、时间等化学反应条件不同的情况下， 不同DAR的ADC所占的比例也不尽相同。当DAR为8时，即满足8个巯基全部偶联载药分子时，所得为定点定量的均一性ADC。但是DAR为4左右或者更低时，很难控制载药通过连接子与相同的4个偶联位点发生反应，也不能保证偶联的载药数量都为4，而可能同时存在DAR为0（裸抗体）、2、4、6、8的ADC，因此所得ADC往往为均一性较差的混合物[6,16]。 图8 半胱氨酸偶联技术 (抗体链间二硫键被还原成含游离巯基的半胱氨酸残基，连接子的马来酰亚胺部分通过游离巯基与还原后的半胱氨酸残基反应进行偶联。IgG1抗体含有4对链间二硫键，可还原为8个游离巯基，因此部分偶联可生成DAR为0-8的ADC混合物，完全偶联可生成DAR为8的均一ADC） 为了减少未偶联药物的裸抗体，以避免和ADC药物竞争性结合HER2。同时也为了避免高DAR的ADC偏多，造成水溶性降低，改变相关理化性质。因此，尽管理论上越高的DAR意味着携带载药数量越多，抗肿瘤活性越强，但是一些ADC药物的DAR水平仍控制在2-4[17,18]。究其原因在于细胞毒性载药大多具有疏水性，而很多传统连接子技术无法克服疏水性较高的问题[19]，若通过额外的疏水基团将疏水性载药与抗体连接可能会产生聚集性，从而加快体内清除率，影响疗效和安全性。为了改善ADC药物的亲水性和维持抗体理化性质，通常就会降低抗体上可实现的载药量[2]。 SYD985最初是由未偶联和偶联抗体组成的异质性混合物（称为SYD983），DAR分别为2、4、6和8。通过疏水作用色谱法进一步纯化SYD983，得到主要含DAR2和DAR4的ADC（命名为SYD985）。SYD985的平均DAR约为2.8，其在体外条件下杀死HER2阳性SK-BR-3细胞的活性是SYD983的2倍。提示尽管相比SYD983在均一性和抗肿瘤活性上得到了提高，但是SYD985仍为含有两种DAR的混合物[6,20,21]。同样采用半胱氨酸偶联的ADC药物RC48，其DAR为4，也为缺乏均一性的混合物[11]。 DS-8201与一般ADC(2-4)相比，具有更高DAR值（DAR=8）。尽管既往研究报告称，DAR越高，体内血浆清除率会变高，但DS-8201通过GGFG四肽的优化连接子技术降低连接子载药的疏水性，从而突破传统认知，在DAR达到8的同时维持了稳定性，实现更好的疗效。既往研究表明，DS-8201在体内外均表现出较强的有效性和可接受的聚集率，并且在小鼠中具有良好的耐受性。不仅如此，较高的DAR也确保了DS-8201在HER2低表达肿瘤细胞中的活性。一项研究表明，针对HER2低表达细胞系，DS-8201(DAR=8)比低DAR ADC更有效。这种现象可以通过与其他ADC相比，每个DS-8201能为靶细胞提供更多有效载荷来解释。这种补偿机制确保了尽管附着在HER2低表达肿瘤细胞表面的DS-8201较少，但仍可将足量的有效载荷携带至靶细胞中，从而有效杀死肿瘤细胞[6]。 定点偶联是指通过各种方法将外源性化学基团引入抗体的特定位点，避免产物异质性。其中一些方法包括在抗体氨基酸序列中插入额外的游离半胱氨酸，或者先插入非天然氨基酸，然后通过点击化学将小分子添加到插入的氨基酸上，或者将小的氨基酸序列插入到抗体中，然后通过酶促反应结合小分子。这些方法均依赖于插入额外反应基团进行偶联的蛋白质工程。虽然在技术上是可行的，但它为ADC生产和可重复性增加了潜在的挑战[6]。ARX788通过“遗传密码子扩充”技术将非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸(pAF) 插入到抗体特定位置，然后含有药物连接子的羟胺与pAF偶联形成稳定的肟键，从而实现药物特异性地连接到抗体上。这种定点偶联方式使得ARX788的均一性更高。在非还原RP-HPLC法中，ARX788主要以DAR2的物质形式分离，DAR值为1.9。虽然ARX788偶联技术有所改进，但是目前该技术的DAR比较低，且ARX788的连接子不可裂解，不能发挥旁观者效应，由此与传统ADC或新一代ADC药物如DS-8201相比的临床优势是什么尚不明确。 图9. 通过基因工程将非天然氨基酸引入抗体中，随后进行化学偶联 (A) 肟连接。(B)铜催化或(C)应变促进（无铜）叠氮化物-炔环化。位点特异性偶联方法根据引入非天然氨基酸残基的数量确定DAR值。 图10. 不同HER2靶向ADC的偶联方式 连接子类型与旁观者效应 上述ADC药物中，DS-8201、SYD985、RC48均报道具有旁观者效应，而T-DM1和ARX788则不具有旁观者效应。对比其特点发现，前者均采用可裂解连接子，且载荷均具有膜渗透性，而后者均采用不可裂解连接子，且载荷均不具有膜渗透性。?这也说明旁观者效应必须满足连接子可裂解，且载荷具有膜渗透性的条件。而对于采用不可裂解连接子的ADC，当ADC进入溶酶体后，其抗体通过蛋白水解机制代谢为其组成氨基酸，因此释放的活性成分通常为氨基酸残基-连接子-载荷形成的复合物，由于氨基酸残基所带电荷限制了其细胞膜渗透性，因而通常不会产生旁观者效应[22]。 图11.旁观者效应 总结 连接子在ADC药物设计中起到了“桥梁”的作用，同时也是ADC研发技术的关键所在，如何优化连接子技术以及采用何种偶联策略等，都是设计理想ADC需要重点思考的问题。目前国内外ADC药物都处在快速发展阶段，尤其在HER2靶向ADC研发赛道上，更是呈现“拥挤”状态，如何在激烈的角逐中脱颖而出，连接子化学将成为关键因素之一。未来希望随着研究的深入和经验的积累，能开发出更多优化的连接子技术，进一步推进ADC药物研发进程。 参考资料： [1]武刚,付志浩,徐刚领,等.抗体偶联药物研发进展[J].生物医学转化,2021,2(04):1-11. 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